在前幾期中我們?yōu)榇蠹医榻B了小腸的結(jié)構(gòu)、功能并為大家分享了腸道隱窩的分離與類器官培養(yǎng)方法。那么培養(yǎng)好的類器官都用來干嘛呢？本期將為大家提供一些腸道類器官的應(yīng)用思路。

目前，類器官主要用于：

（1）模擬器官的發(fā)育和形態(tài)發(fā)生

基于類器官的研究已經(jīng)為闡明腸道干細(xì)胞龕復(fù)雜的調(diào)控功能做出了突出的貢獻(xiàn)，尤其是通過類器官實(shí)驗(yàn)，人們發(fā)現(xiàn)了R-spondins的受體Lgr4和Lgr5(de Lau et al. 2011)。

（2）模擬疾病

類器官可用來模擬疾病，主要通過引入與疾病相關(guān)的突變來模擬功能。通過從患者身上提取細(xì)胞進(jìn)行類器官培養(yǎng)來闡明其發(fā)病機(jī)制。近年來，腸道類器官作為囊性纖維化和結(jié)直腸癌的診斷工具受到越來越多的關(guān)注(Dekkers et al., 2016a ; van de Wetering et al., 2015 )。患者來源的腸道類器官可以重現(xiàn)上皮功能和基因特征，結(jié)直腸癌患者來源的類器官可展現(xiàn)原發(fā)腫瘤的多種生物學(xué)特征。

（3）組織再生醫(yī)學(xué)

鑒于腸道類器官移植的可行性已被證實(shí)，腸道類器官可能成為一種治療手段( Yui et al., 2012)，這為再生醫(yī)學(xué)和整合基因編輯技術(shù)的基因治療開辟了新的可能性(Dekkers et al., 2016b)。目前腸道類器官技術(shù)依然處于快速發(fā)展階段，基于培養(yǎng)流程的普及和培養(yǎng)成本的降低，類器官技術(shù)在研究中的應(yīng)用愈加廣泛，并將逐漸開始應(yīng)用于新的領(lǐng)域。

（4）個(gè)體化用藥

此外，類器官以一種個(gè)體化的方式預(yù)測(cè)藥物療效，類器官技術(shù)結(jié)合高通量藥物篩選，將加速檢測(cè)基因-藥物之間的關(guān)聯(lián)性 (van de Wetering et al., 2015)。

腸道類器官熱門應(yīng)用

一、營(yíng)養(yǎng)模型

最近幾年，涉及轉(zhuǎn)運(yùn)體和受體的生理過程受到越來越多的關(guān)注，人們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運(yùn)體在腸道中發(fā)揮著雙向功能(Zietek and Daniel,2015)。除了具有在吸收性腸上皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)功能，轉(zhuǎn)運(yùn)體還在分泌激素的內(nèi)分泌細(xì)胞的頂端膜扮演著感受器的作用(Gorboulev et al.,2012)，調(diào)控腸促胰島素釋放進(jìn)入血液(Diakogiannaki et al.,2013;Roder et al.,2014)。既往研究中，腸道受體也被證明具有類似的調(diào)節(jié)腸道激素分泌的功能( Reimann et al.,2012 )。腸促胰島素GLP-1和GIP具有促進(jìn)胰島素分泌的功能，對(duì)調(diào)節(jié)血糖水平至關(guān)重要。在腸內(nèi)分泌細(xì)胞中，轉(zhuǎn)運(yùn)體和受體作為傳感器，成為2型糖尿病療法開發(fā)中具有高度潛力的靶點(diǎn)(Gribble and Reimann,2016;Zictek andDaniel,2015)。

在腸上皮細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)、藥物的吸收功能和內(nèi)分泌細(xì)胞的激素分泌功能等方面(Petersen et al. ,2014;Schweinlinet al.,2016;Zietek et al., 2015 )。這些過程與營(yíng)養(yǎng)吸收障礙疾病、藥物檢測(cè)和代謝紊亂疾病(如肥胖或2型糖尿病)高度相關(guān)，由于腸道類器官可以呈現(xiàn)體內(nèi)組織結(jié)構(gòu)的重要特點(diǎn)，因此它成為高度分化的、功能健全的腸上皮細(xì)胞的良好來源。

除此之外，通過利用特定的調(diào)節(jié)因子如γ-分泌酶抑制劑，類器官還可富集腸道稀有細(xì)胞類型，如腸內(nèi)分泌細(xì)胞，其在正常生理?xiàng)l件下僅占腸上皮細(xì)胞的1%(Petersen et al.,2015)。以此為基礎(chǔ)的類器官培養(yǎng)將極大地促進(jìn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)科學(xué)研究具有深遠(yuǎn)的影響。

用于腸道營(yíng)養(yǎng)研究的類器官模型

設(shè)計(jì)思路

研究證實(shí)，腸道類器官包含腸上皮的所有細(xì)胞類型(Sato et al.,2009;Spence et  al., 2011)，包括分泌GIP和GLP-1的腸內(nèi)分泌細(xì)胞( Petersen et al.,2014;Petersen et al. 2015)。類器官可來自小鼠或人的腸道組織，用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)，并可在實(shí)驗(yàn)室通過傳代培養(yǎng)數(shù)月，因此，最近研究者在探究小鼠腸道類器官是否可以成為用于腸道轉(zhuǎn)運(yùn)、感知和激素分泌研究的體外模型(Zietek et al.,2015)，由于腸道營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)體特異性表達(dá)于膜的頂部或基底外側(cè)，因此類器官的上皮包含極化的腸上皮細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，許多營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)體，如SGLT1、PEPT1或GLUT5，均表達(dá)于面向腸腔的頂端膜，以從消化的食物中吸收營(yíng)養(yǎng)(Daniel and Zietek,2015)。然而，其他一些營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)體，如氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體或GLUT2，則表達(dá)于基底膜，從而介導(dǎo)來自腸上皮細(xì)胞的養(yǎng)分進(jìn)入血液循環(huán)(Roder et al. 2014)，因此，保證目的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白定位在腸道類器官的正確位置是非常重要的。

在研究特定激素分泌時(shí)，確保類器官培養(yǎng)中包含腸內(nèi)分泌細(xì)胞亦非常必要，最簡(jiǎn)便的方法便是將類器官包埋于石蠟中，進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。在研究轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(或其它腸道蛋白)時(shí)，推薦利用缺乏目的蛋白表達(dá)的敲除小鼠進(jìn)行類器官培養(yǎng)來驗(yàn)證染色的特異性。根據(jù)不同的目的蛋白，在構(gòu)建類器官時(shí)選擇正確的部位較為關(guān)鍵，腸道部位與腸道激素分泌的研究也同樣相關(guān)，不同亞型的腸內(nèi)分泌細(xì)胞分布在腸道的不同部位。值得注意的是，從近端小腸到遠(yuǎn)端小腸，分離所得到的隱窩明顯減少，培養(yǎng)所得到的類器官也明顯減少。在研究營(yíng)養(yǎng)感知時(shí)，如果所研究的傳感器蛋白的表達(dá)位置與目標(biāo)腸內(nèi)分泌細(xì)胞亞型的分布位置不同則需要做出折中。

類器官用于腸道轉(zhuǎn)運(yùn)、感知、激素分泌示意圖

二、體內(nèi)外系統(tǒng)橋梁

宿主-微生物相互作用是指微生物(如細(xì)菌、寄生蟲、病毒)與宿主(如人類、動(dòng)物)之間發(fā)生的相互作用，宿主-微生物相互作用的研究需要合適的模型系統(tǒng)來模擬體內(nèi)感染。在過去的幾十年里，研究者們采用了各種體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠硌芯克拗髋c微生物的相互作用，這些模型的最終目的是在體外創(chuàng)建一個(gè)能夠模擬人體真實(shí)情況的環(huán)境，以闡明健康和疾病中宿主反應(yīng)的生理機(jī)制。這些模型包括來源于人或動(dòng)物細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)系(Dingli and Nowak,2006)，可經(jīng)口或接種感染病原體的選定動(dòng)物模型(Fang et al.,2013)，以及模擬宿主-細(xì)菌相互作用的類器官(Fatehullah et al.,2016)。對(duì)于某些感染因子而言，目前完全缺乏良好的模型系統(tǒng)，而對(duì)于另一些感染因子，現(xiàn)有的模型也并非最佳。

非類器官方法及類器官方法在宿主-細(xì)菌相互作用研究中的優(yōu)缺點(diǎn)如下。

腸道上皮是成年哺乳動(dòng)物中自我更新速度最快的組織，它包括一系列分化的細(xì)胞類型，每個(gè)類型都有其自身的特性。大多數(shù)用于研究沙門菌和腸道上皮細(xì)胞之間相互作用的體外模型無法重現(xiàn)在正常腸道中觀察到的分化組織成分和結(jié)構(gòu)。創(chuàng)建分化細(xì)胞的一種方法是通過懸浮培養(yǎng)技術(shù)，該技術(shù)使用旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器使細(xì)胞保持懸浮并無氣泡通氣，以這種方式形成的三維(3D)聚合體的特征在于具有細(xì)胞極性、細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和器官特異性分化。然而，該系統(tǒng)可能缺乏負(fù)責(zé)腸道組織更新的正常干細(xì)胞生態(tài)位(Zhang et al.,2014)。

新近發(fā)展起來的類器官模型充當(dāng)了體內(nèi)外系統(tǒng)之間的橋梁，Ootani等報(bào)道了一種復(fù)雜的培養(yǎng)體系，即在基質(zhì)細(xì)胞的支持下，將整個(gè)腸組織切片包埋在3D膠原結(jié)構(gòu)中(Ootani et al.,2009)。Sato及其同事建立了一個(gè)相對(duì)簡(jiǎn)單的類器官培養(yǎng)系統(tǒng)，使用基質(zhì)膠作為ECM替代品，并輔以構(gòu)成關(guān)鍵內(nèi)源性生態(tài)位信號(hào)的生長(zhǎng)因子。該系統(tǒng)已被用于創(chuàng)建具有明顯隱窩和絨毛樣結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與中央管腔相鄰，其中包含從不斷更新的上皮層中擠出的死細(xì)胞(Sato et al.,2009)。類器官如實(shí)再現(xiàn)了體內(nèi)上皮結(jié)構(gòu)，并包含完整的干細(xì)胞、祖細(xì)胞和分化細(xì)胞類型(Fatehullah et al.,2016;Sato et al.,2009)。此后，腸道類器官被用于基礎(chǔ)和臨床研究的各個(gè)方面，包括用于產(chǎn)生人腸道類器官，以及用于從具有不同遺傳修飾的動(dòng)物模型中產(chǎn)生類器官。

設(shè)計(jì)思路

利用來源于隱窩的小鼠腸道類器官，研究者能夠直觀觀察鼠傷寒沙門菌的侵襲性以及類器官的形態(tài)變化(Zhang et al.,2014)。在類器官中，結(jié)構(gòu)域與中央管腔相鄰，中央管腔含有從不斷更新的上皮層擠出的死細(xì)胞，研究者利用致病性傷寒沙門菌14028S(10°CFU)定植感染培養(yǎng)物。第一個(gè)30min的孵育使細(xì)菌接觸到類器官細(xì)胞表面，30min后，用Hank's平衡鹽溶液(Hank's balanced salt solution,HBSS)洗去細(xì)胞外細(xì)菌。之后，將受感染的類器官在含有慶大霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1h。研究人員發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染顯著抑制了類器官的生長(zhǎng)，包括出芽和類器官培養(yǎng)物的總面積。鼠傷寒沙門菌進(jìn)入類器官的上皮細(xì)胞，導(dǎo)致緊密連接的破壞。例如，在沙門菌感染的類器官中，緊密連接(tight junction,TJ)蛋白ZO-1染色減少并斷開連接(圖13.1)。有趣的是，TJ蛋白Claudin7似乎沒有受到影響。

在感染沙門菌的類器官中檢測(cè)了基于NF-kB通路激活的炎癥反應(yīng)。沙門菌感染的類器官中總kBα顯著減少，磷酸化IkBα增加，磷酸化NF-kB p65也有所增加。通過共聚焦顯微鏡觀察，研究人員發(fā)現(xiàn)NF-kB p65已轉(zhuǎn)移到感染沙門菌的類器官的細(xì)胞核中。作為NF-kB激活的下游靶點(diǎn)，與沒有任何感染的類器官相比，受感染類器官中的炎性細(xì)胞因子(例如，IL-2、IL-4、IL-6和TNF-a)顯著增加，而且，ELISA對(duì)沙門菌感染后1h培養(yǎng)液中IL-6蛋白的檢測(cè)靈敏度足夠高。感染1、2、4h后，培養(yǎng)基中的ⅡL-6 蛋白顯著增強(qiáng)(Zhang et al.,2014)。此外，western blot、PCR和免疫熒光數(shù)據(jù)表明，沙門菌感染(使用GFP標(biāo)志的Lgr5類器官)顯著降低了干細(xì)胞標(biāo)志物(Lgr5和Bmil)。

小鼠腸道類器官培養(yǎng)基套裝推薦

因此，研究者首次建立了一個(gè)體外模型系統(tǒng)，再現(xiàn)了沙門菌感染腸道的體內(nèi)研究中的一些觀察結(jié)果，包括沙門菌入侵、緊密連接結(jié)構(gòu)破壞、炎癥細(xì)胞因子增加以及宿主-細(xì)菌相互作用期間干細(xì)胞標(biāo)志物減少等。該研究證明，沙門菌感染的類器官培養(yǎng)系統(tǒng)是研究宿主-細(xì)菌相互作用的一種全新的、可行的實(shí)驗(yàn)工具。

Forbester等利用來源于人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)的腸道類器官(intestinal organoids,iHOs)(Forbester et al.,2014;Forbester et al. 2015),建立了類器官腔內(nèi)微量注射鼠傷寒沙門菌的方法。RNA測(cè)序顯示，與對(duì)照組相比，感染了鼠傷寒沙門菌的腸道類器官中1448個(gè)基因顯著上調(diào)、577個(gè)基因顯著下調(diào)；上調(diào)的基因包括編碼促炎細(xì)胞因子的基因，如CCL20、IL1B和IL23A等。利用缺失SPI-1 Ⅲ型分泌系統(tǒng)中invA組分的鼠傷寒沙門菌突變株，F(xiàn)orbeste等證明該系統(tǒng)可用于功能性評(píng)估特定突變體的發(fā)病機(jī)制(Forbester et al.,2014;Forbester et al.,2015)。

顯微注射含細(xì)菌的類器官可以在相對(duì)可控的環(huán)境中模擬細(xì)菌感染，在沒有免疫細(xì)胞或共生菌引入混雜變量的情況下，可以直接檢測(cè)病原體與上皮細(xì)胞的相互作用。Wilson等報(bào)道，野生型小鼠和Mmp7小鼠類器官中的Paneth細(xì)胞產(chǎn)生含有α-防御素的顆粒。

類器官形成一個(gè)密閉的管腔，其中含有一定濃度的α-防御素，能夠在感染后至少20h內(nèi)限制鼠傷寒沙門菌的生長(zhǎng)( Wilson et al.,2015)。

除了致病性細(xì)菌研究外，類器官還可用于共生菌、益生菌以及微生物組學(xué)研究。例如，離子組成和pH的區(qū)域特異性變化與管腔和黏膜相關(guān)細(xì)菌的區(qū)域特異性改變相關(guān)，一般來說，厚壁菌門(Firmicutes)普遍減少，而擬桿菌門(Bacteroidetdes)成員增加(如多形擬桿菌)(Engevik et al.,2013)。在野生型和NHE3末端回腸類器官中接種多形擬桿菌均顯示fut2和巖藻糖基化增加。這些數(shù)據(jù)表明，單獨(dú)的多形擬桿菌足以在體內(nèi)觀察到增加的巖藻糖基化(Engevik et al.,2013)。

三、近年其他應(yīng)用腸道類器官應(yīng)用思路及論文推薦

文章1：Recapitulating macro-scale tissue self-organization through organoid bioprinting

文章簡(jiǎn)介：開發(fā)了一種生物打印輔助的組織形成方法，通過3D生物打印引導(dǎo)控制幾何形狀和細(xì)胞密度形成具有自組織特征的納米級(jí)組織，可形成類似腸胃交界處的組織。

文章2：Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration

文章簡(jiǎn)介：提出了一種構(gòu)建研究腸上皮損傷后再生的類器官模型，并揭示了兩種表觀遺傳調(diào)節(jié)因子在調(diào)控腸道損傷后再生過程中的關(guān)鍵作用和機(jī)制的方法。

作為“萬病之源”，所有已知的人類疾病中高達(dá)90%都可追溯道不健康的腸道。因此，腸類器官并不局限于腸道疾病研究。

腸道與心臟發(fā)育

文章1：Co-emergence of cardiac and gut tissues promotes cardiomyocyte maturation within human iPSC-derived organoids

文章簡(jiǎn)介：證明了類器官中內(nèi)胚層組織（腸）的存在有助于心臟管形成后階段特征的心臟組織特征的發(fā)展，包括心肌細(xì)胞擴(kuò)張、區(qū)室化、心房/淋巴結(jié)細(xì)胞富集、心肌壓實(shí)和胎兒樣功能成熟。總體而言，這項(xiàng)研究證明了在單個(gè)類器官模型中產(chǎn)生和成熟來自不同種譜系的合作組織的能力，這一進(jìn)展將進(jìn)一步檢查發(fā)育，生理成熟和疾病過程中的多組織相互作用。

腸道與抗癌

文章2：The  Intestinal  Microbiota Modulates the  Anticancer Immune Effects of Cyclophosphamide

文章簡(jiǎn)介：環(huán)磷酰胺改變了小腸中微生物群的組成，并誘導(dǎo)選定的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌物種易位到次級(jí)淋巴器官。以此表明腸道微生物有助于抗癌作用。

腸道與睡眠

文章3：A gut-secreted peptide suppresses arousability from sleep

文章簡(jiǎn)介：高等腸道中的蛋白質(zhì)濃度導(dǎo)致腸內(nèi)分泌細(xì)胞活性增加釋放肽CCHa1，CCHa1向一小群多巴胺神經(jīng)元發(fā)出信號(hào)在大腦中調(diào)節(jié)其活動(dòng)；多巴胺能活性調(diào)節(jié)行為動(dòng)物對(duì)振動(dòng)的反應(yīng)。

類器官專用基質(zhì)膠推薦

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關(guān)于模基

廈門?；锟萍加邢薰荆╔iamen Mogengel）位于中國(guó)·廈門國(guó)家高新技術(shù)創(chuàng)業(yè)中心。公司致力于3D細(xì)胞培養(yǎng)核心原材料的研發(fā)與產(chǎn)業(yè)化升級(jí)。目前公司的產(chǎn)品有基質(zhì)膠、類器官培養(yǎng)基、細(xì)胞因子、3D細(xì)胞培養(yǎng)耗材、3D細(xì)胞培養(yǎng)智能顯微鏡等。公司擁有4大技術(shù)研發(fā)中心：分子克隆和細(xì)胞編輯中心、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心、蛋白表達(dá)和純化平臺(tái)、類器官質(zhì)檢系統(tǒng)和自動(dòng)化。

團(tuán)隊(duì)擁有十余年類器官技術(shù)研究基礎(chǔ)，實(shí)力雄厚，科研意志堅(jiān)定，學(xué)術(shù)態(tài)度嚴(yán)謹(jǐn)，大膽嘗試，勇于創(chuàng)新。公司推出的基質(zhì)膠、類器官培養(yǎng)試劑盒等產(chǎn)品廣泛適用于類器官培養(yǎng)、血管生成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲（transwell）實(shí)驗(yàn)、PDX、CDX模型實(shí)驗(yàn)、腫瘤球培養(yǎng)、腫瘤移植、皮下成瘤實(shí)驗(yàn)、干細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞分化研究以及其他待開發(fā)實(shí)驗(yàn)類型。